Umzug Next-Generation Sequencing in der Klinik, Teil 2

first attempt at live tweets from #ngs2013 http://t.co/SbWrGx8weI

— Paul Denny (@ Pauldennyuk) März 12, 2013

In my last post, Ich fasste die ersten vier Vorträge von diesem Symposium:

1st Oxford Werkstatt und Symposium, 4th Techgene Knowledge Network Meeting,
“NGS2013 Next Generation Sequencing: Bioinformatik und Data Analysis”

Sie können auch lesen Sie die Tweets aus der Sitzung hier. But I digress. The afternoon session started impressively with Marcel Nelen, from Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Netherlands speaking about:

“Clinical utility of exome sequencing in heterogeneous diseases.”

Dr Nelen described how a strong collaboration between research and diagnostics labs led to the application of exome sequencing in diagnosis of heterogeneous genetic diseases.  He emphasised the importance of a multidisciplinary team effort to define “packages” of genes for which there was evidence of involvement in either intellectual disability (ID), inherited blindness, inherited deafness, movement disorder or oxidative phosphorylation disorders. Die breite Vielfalt der genetischen Varianten, die solche Krankheiten verursachen können bedeutet, dass Sanger-Sequenzierung, einmal der Goldstandard, geworden zu zeitaufwendig und teuer und gibt eine untere “diagnostische Ausbeute” als exome Sequenzierung.

Ein kritischer Aspekt der Anwendung von Hochdurchsatz-Sequenzierung von exomes in einem diagnostischen Einstellung gewinnt entsprechende Einwilligung von Patienten und ihren Familien. Patienten und / oder deren Eltern gaben informierte Zustimmung für die gesamte Analyse exome. Die Sequenzdaten der exomes von ~ 550 Patienten trat eine allgemeine Anmerkung Pipeline und exome Analyse wurde auf beiden eine Basis 'de novo"Strategie für ID oder ein 'in silico"Gezielte Strategie für die anderen Krankheiten.

Analyse basiert auf einem zweistufigen Ansatz:

1.  Analysis of a “package” of genes defined as highly likely to carry pathogenic variants:
   • Search for variants in only these disease-related genes.
   • If pathogenic variant found, end analysis and report.
   • If no pathogenic variant found, move on to the second stage:
2. Whole exome analysis:
   • If no pathogenic variant found, search for mutations in a specific  set of candidate genes.
   • If a pathogenic variant is found and there is solid proof for clinical interpretation, report.
   • Schließlich, if the earlier analyses fail, the remainder of the exome  is searched in collaboration with researchers and might be reported on if this “new” data holds.

One success story recounted by Dr Nelen concerned a specific case of intellectual disability, in denen keine ursächliche Variante hatte über mehrere Jahre der Forschung wurde durch Sanger-Sequenzierung von aufeinanderfolgenden Kandidatengene identifiziert, wohingegen ganze exome Analyse identifiziert eine pathogene Variante in diePACS1 Gen.

In Fällen, in denen “Nebenkosten” Varianten identifiziert, das scheint keine Beziehung zu der Krankheit tragen untersucht, diese werden weitergegeben und ausgewertet von einem unabhängigen Team von Experten um Rat., vor Berichterstattung.

Dieses abgestufte Analyse hat die Zertifizierung durch die niederländischen Gesundheitsbehörden als Gentest gewonnen und so könnte als Modell für andere EU-Länder handeln.

Wir hörten von Michael Mueller nächsten, vom NIHR Biomedical Research Centre, Imperial College London, Vereinigtes Königreich, über:

“Schnelle Ganzkörper-Genom-Sequenzierung: Optimierung der Bioinformatik-Pipeline für schnellere Durchlaufzeiten.”

Mit Ganzkörper-Genom-Sequenzierung (WGS) zum Mutationsnachweis kann stärker sein als Analyse beschränkt, um nur die exome. Jedoch, die Daten der Verarbeitung und Handhabung Herausforderungen, indem WGS in der diagnostischen Labor gestellt sind immens. Dr. Müller beschrieben, wie verschiedene Hardware und Ansätze zur parallelen Verarbeitung von NGS-Daten optimiert werden könnte, präsentiert einige dramatische Verbesserungen. Durch die systematische Ermittlung von Engpässen in jeder Phase, er war in der Lage, die Zeit genommen, kommentierte Varianten produzieren reduzieren, beginnend mit rohen Illumina kurz-Daten aus einer ~ 30x Coverage einzigen Genoms, von ~ 24 bis ~ 7 Stunden. Dies schien ohne Lese-Mapping oder Variante Aufruf Qualität erreicht werden.

In einer Follow-up zur Diskussion von Marcel Nelen, Kornelia Neveling, auch von der Radboud University Medical Center, Nijmegen, sprach über:

“Datenanalyse für diagnostische Sequenzierung exome”

Dr. Neveling begann mit der Beschreibung der technischen Einrichtung an der Radboud University Medical Center, dann Probenhandling und Qualitätskontrolle und schließlich Software-Tools, um in exome Sequenzvariante Filterung und Analyse helfen. Der Diagnose-Labor hat Zugriff auf drei Life Technologies 5500 Sequenzer mit der soliden Plattform sowie zwei Ion Torrent PGM-Sequenzer.

Ein entscheidender Schritt in Probe und Datenverarbeitung ist die Qualitätskontrolle (QC) um sicherzustellen, dass die endgültigen klinischen Entscheidungen robust; einige der QC Schritte von Dr. Neveling galten:

1. Zuverlässige Identifikation von Personen und Beziehungen (Geschwister / Eltern / nicht verwandt)
2. Exakte Erfassung von Metadaten für jede Probe zB. die Software-Version wurde für die Analyse verwendet? Was war das Datum der Analyse?, etc.
3. Das Sequenzdaten sind hochspezifische und sensitive zB. geben ausreichend, gleichmäßige Abdeckung aller Exons.
4. Sequenzvariante Anrufe treffen biologischen Erwartungen zB. das Verhältnis von Übergängen zu Transversionen spiegelt natürliche Variation.

Die Radboud Sequenzierung Diagnostik Team haben jetzt eine Datenbank mit über 1500 einzelnen exomes und haben festgestellt, dass eine typische exome ergibt etwa 40,000 Varianten, mit ~ 150-200 dieser Varianten ist “Private” Zu jeder Probe. Dr. Neveling präsentiert eine Variante Filter-Tools, mit einer grafischen Benutzeroberfläche, die an die Software sahzuvor beschriebenen von Elliot Margulies und kurz beschrieben mit dem Werkzeug in einem Fall der hereditären spastischen Paraplegie, um bei der Identifizierung der wahrscheinlichsten Variante ätiologische helfen.

Prof. Anthony J Brookes endete das Symposium, reden:

“Zuweisen Pathogenität für NGS-Varianten abgeleitet”

Prof. Brookes wurde mit Ideen fizzing, provozieren uns über das, was wir wirklich denken, durch meine “pathogenen”. Die Konzentration auf seltene Krankheiten, wurden wir daran erinnert, dass das Konzept der Pathogenität ein rutschiger ist, vielschichtig. Herleitung Pathogenität kann bedeuten, eine Kombination aus:

• Wissenswertes Allelhäufigkeiten bei und Kontrolle Populationen
• ob eine Variante wurde von anderen als pathogene beschriebenen
• ob eine Variante fehlt von Datenbanken, die angenommen (manchmal falsch) , hauptsächlich bestehen aus “normalen” Varianten z.B.. dbSNP
• ob eine Variante co-segregiert mit der Krankheit in einem Stammbaum
• was die vorhergesagte (oder bekannte) Wirkung einer Variante ist auf die Proteinstruktur
• Vorhersagen in silico von Tools wie PolyPhen oder Sift
• funktionelle Assays in lebenden menschlichen Zellen durchgeführt
• funktionale oder phänotypische Tests in Modellorganismen durchgeführt zB. Mausmutanten

Eine weitere Ebene der Subtilität in der Art und Weise, in der wir definieren Pathogenität ist, dass wir von zwei Kontexten denken:

1. hat eine Variante 'verursacht’ ein Phänotyp bei einem bestimmten Patienten oder der Familie (der sich auf Expressivität)?
2. können Eine Variante 'Ursache’ ein Phänotyp in einer Population (Penetranz)?

Prof. Brookes argumentiert, dass die klinischen Handlungsfähigkeit einer Variante sollte als eine Kombination von Pathogenität gedacht werden, Penetranz und Expressivität. Er wies weiter darauf hin, dass zu wenig über die Beziehung zwischen Genotyp und Phänotyp und dass wir eine Reihe von Entwicklungen, diese Lücke zu überbrücken und unsere Fähigkeit verbessern, pathogenen Varianten erkennen ist bekannt. Insbesondere, Er argumentierte, dass ein Vermittler Datenbanksystem erforderlich war, um miteinander verknüpfen primären Ressourcen wie dbSNP oder Ensembl mit klinischen Datenbanken, Daten-Sharing, ohne Vertraulichkeit erleichtern. Die Kombination dieser Datenbank 'Ökosystem’ mit hoher Daten-Qualität elektronischen Patientenakten sollte zur Verbesserung unseres Verständnisses der Genotyp-Phänotyp-Beziehung.

Das Symposium gab einen guten Überblick über die Art und Weise, in der NGS gerade dabei ist, in der diagnostischen genetischen Labors übernommen und verwendet, um die Erfolgsquote zu verbessern bei der Identifizierung ursächlicher Varianten. Wiederum, diese technologische Entwicklung sollte besser informierte Wahl von Therapien oder Behandlungen führen. Es ist faszinierend zu sehen, wie weit wir in einem Jahr fortgeschritten, wenn ein Followup ist nicht geplant.

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