Déplacement séquençage de prochaine génération dans la clinique, partie 2

première tentative de tweets en direct de #ngs2013 http://t.co/SbWrGx8weI

— Paul Denny (@ Pauldennyuk) Mars 12, 2013

Dans mon dernier message, J'ai résumé les quatre premières discussions de ce colloque:

1st Oxford Atelier et Symposium, 4e Techgene Réunion Knowledge Network,
“NGS2013 de séquençage de nouvelle génération: Bioinformatique et analyse des données”

Vous pouvez également lire les tweets de la réunion ici. Mais je m'éloigne du sujet. L'après-midi a commencé avec Marcel impressionnante Nelen, à partir de Radboud University Medical Centre, Nimègue, Pays-Bas parler:

“L'utilité clinique de séquençage exome dans les maladies hétérogènes.”

Dr Nelen décrit comment une collaboration étroite entre la recherche et les laboratoires de diagnostic conduit à l'application de séquençage exome dans le diagnostic des maladies génétiques hétérogènes. Il a souligné l'importance d'un travail d'équipe pluridisciplinaire afin de définir “forfaits” de gènes pour lesquels il y avait des preuves de l'implication dans les deux déficience intellectuelle (ID), cécité héréditaire, surdité héréditaire, des troubles du mouvement ou de troubles phosphorylation oxydative. La grande diversité des variantes génétiques qui peuvent causer des maladies telles signifie que le séquençage Sanger, une fois l'étalon-or, est devenue trop longue et coûteuse et donne une plus faible “rendement diagnostique” exome de séquençage.

Un aspect critique de l'application de séquençage à haut débit de exomes dans un cadre de diagnostic gagne le consentement éclairé des patients et de leurs familles. Les patients et / ou leurs parents ont donné leur consentement éclairé pour l'analyse exome ensemble. Les données de séquence des exomes de ~ 550 patients entrés dans une canalisation d'annotations génériques et l'analyse exome a été basée soit sur un 'encoreLa stratégie pour l'ID ou un 'in silico«Stratégie ciblée pour les autres maladies.

L'analyse est basée sur une approche en deux étapes:

1. Analyse d'un “paquet” des gènes définis comme hautement susceptible de porter variantes pathogènes:
   • Rechercher variantes que ces gènes liés à la maladie.
   • Si variant pathogène trouvé, l'analyse et le rapport final.
   • Si aucun variant pathogène trouvé, passer à la deuxième étape:
2. Toute analyse exome:
   • Si aucun variant pathogène trouvé, recherche de mutations dans un ensemble spécifique de gènes candidats.
   • Si un variant pathogène est découvert, et il existe une preuve solide pour l'interprétation clinique, signaler.
   • Enfin, si les analyses antérieures ne, le reste de la exome est recherché en collaboration avec des chercheurs et peut être rapporté si cette «nouvelle» de données contient.

Une success story racontée par le Dr Nelen concernait un cas spécifique de la déficience intellectuelle, dans lequel aucune variante causal a été identifié au cours de plusieurs années d'enquête par séquençage Sanger de gènes candidats successifs, alors que toute analyse exome identifié un variant pathogène dans leGène PACS1.

Dans les cas où “accessoire” variants sont identifiés, qui semblent n'avoir aucun rapport avec la maladie étudiée, ceux-ci sont passés vers et évaluée par une équipe indépendante d'experts pour obtenir des conseils, avant de se présenter.

Cette analyse à plusieurs niveaux a obtenu la certification par les autorités néerlandaises médicaux comme un test génétique et pourrait donc servir de modèle pour d'autres pays de l'UE.

Nous avons entendu à côté de Michael Mueller, de l'INDH recherche biomédicale Centre, Imperial College de Londres, Royaume-Uni, sur:

“Rapid ensemble séquençage du génome: optimiser le pipeline bioinformatique pour des délais plus courts.”

En utilisant le séquençage du génome entier (WGS) pour la détection de mutations peut être plus puissante que l'analyse restreinte à la exome. Cependant, le traitement des données et de manutention défis posés par les WGS mobiles dans le laboratoire de diagnostic sont immenses. Dr Mueller décrit la façon dont différents matériels et méthodes de traitement parallèle des données de l'END peut être optimisé, présentant quelques améliorations spectaculaires. Par systématiquement les goulets d'étranglement d'identification à chaque étape, il a été en mesure de réduire le temps nécessaire pour produire des variants annotées, en commençant par Illumina premières à court de lecture de données à partir d'un génome ~ 30x protection individuelle, à partir de ~ 24 à ~ 7 heures. Cela semble être atteint sans compromettre lecture de cartographie ou d'une variante de la qualité d'appel.

Dans le cadre du suivi de la conférence de Marcel Nelen, Kornelia Neveling, également du Centre médical de l'Université Radboud, Nimègue, parlé:

“L'analyse des données de diagnostic exome séquençage”

Dr Neveling a commencé par décrire la configuration technique du Centre médical de l'Université Radboud, puis la manipulation des échantillons et contrôle de la qualité et des outils logiciels pour aider enfin à un filtrage variant de séquence exome et l'analyse. Le laboratoire de diagnostic a accès à trois Life Technologies 5500 séquenceurs utilisant la plate-forme solide et aussi deux Ion Torrent PGM séquenceurs.

Une étape cruciale dans la manipulation des échantillons et des données de contrôle de qualité est (QC) veiller à ce que les décisions finales cliniques sont robustes; certaines des étapes décrites par le Dr QC Neveling étaient:

1. L'identification fiable des personnes et des relations (enfant de mêmes parents / mère / sans rapport)
2. Enregistrement précis des métadonnées pour chaque échantillon, par exemple. la version du logiciel qui a été utilisé pour l'analyse? Quelle est la date de l'analyse?, etc.
3. Que les données de séquence sont par exemple très spécifique et sensible. donner suffisamment de, même la couverture de tous les exons.
4. Appels variantes de séquences biologiques par exemple, répondre aux attentes des. le rapport de transitions à transversions reflète la variation naturelle.

Le séquençage Radboud diagnostics équipe ont maintenant une base de données d'environ 1500 exomes individuels et ont constaté que les rendements typiques exome un sujet 40,000 variantes, avec ~ 150-200 de ces variantes étant “privé” pour chaque échantillon. Dr Neveling présenté un outil variante de filtrage, avec une interface utilisateur graphique qui regardait pas sans rappeler le logicieldécrit précédemment par Margulies Elliot et décrit brièvement à l'aide de l'outil dans un cas de paraplégie spastique héréditaire pour aider à identifier la variante la plus probable étiologique.

Prof. Anthony J Brookes a mis fin au Symposium, parle:

“Affectation pathogénicité vis-à-END dérivés variantes”

Prof. Brookes a été pétillement d'idées, provoquant que nous réfléchissions à ce que nous voulons dire par “pathogène”. Mettre l'accent sur les maladies rares, on nous a rappelé que le concept de la pathogénicité est une glissante, multiples facettes une. Inférer pathogénicité peut signifier une certaine combinaison de:

• sachant la fréquence des allèles dans les populations de cas et de contrôle
• si une variante a été décrite par d'autres pathogènes
• si une variante est absent des bases de données qui sont supposés (parfois à tort) consister principalement en “normal” variantes e.g. dbSNP
• si une variante de co-ségrégation de la maladie dans un pedigree
• ce qui prédit l' (ou connue) effet d'une variante de structure de la protéine est
• prédictions in silico d'outils tels que PolyPhen ou Sift
• analyses fonctionnelles réalisées dans les cellules vivantes humaines
• analyses fonctionnelles ou phénotypiques réalisées dans des organismes modèles, par exemple. souris mutantes

Un autre niveau de subtilité dans la façon dont nous définissons la pathogénicité est que nous ne pouvons penser à deux contextes:

1. a une variante «causé’ un phénotype chez un patient particulier ou une famille (qui se rapporte à expressivité)?
2. boîte une variante «cause’ un phénotype dans une population (pénétrance)?

Prof. Brookes a fait valoir que le actionability clinique d'une variante devrait être considéré comme une combinaison de pathogénicité, pénétrance et expressivité. Il a poursuivi en soulignant que trop peu est connu au sujet de la relation entre le génotype et le phénotype et que nous avons besoin d'un certain nombre de développements de combler cette lacune et d'améliorer notre capacité à reconnaître des variantes pathogènes. En particulier, il a fait valoir qu'un système de base de données intermédiaire est nécessaire de relier entre eux les ressources primaires telles que dbSNP ou Ensembl des bases de données cliniques, afin de faciliter le partage des données sans compromettre la confidentialité. La combinaison de l'écosystème de cette base de données '’ avec des données de haute qualité des dossiers de santé électroniques devrait permettre d'améliorer notre compréhension de la relation génotype-phénotype.

Le symposium a donné un bon aperçu de la façon dont NGS est repris dans de diagnostic des laboratoires génétiques et utilisées pour améliorer le taux de réussite dans l'identification des variants pathogènes. À son tour,, ce développement technologique devrait conduire à un choix éclairé meilleure des thérapies ou des traitements. Il sera intéressant de voir à quel point nous avons progressé en un an, quand une réunion de suivi est prévue.

Si quelqu'un souhaite entrer en contact pour discuter, corriger ou mettre à jour mes résumés, s'il vous plaît envoyer un commentaire, au-dessous, ou envoyez-moi un tweet:

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