Mover secuenciación de próxima generación en la Clínica, parte 2

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— Paul Denny (@ Pauldennyuk) Marzo 12, 2013

En mi último mensaje, Resumí las primeras cuatro charlas de este simposio:

1Oxford st Taller y Simposio, 4ª Reunión de la Red del Conocimiento Techgene,
“NGS2013 secuenciación de próxima generación: Bioinformática y Análisis de Datos”

También puede leer los tweets de la reunión aquí. Pero estoy divagando. La sesión de la tarde comenzó impresionante con Marcel Nelen, de Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Países Bajos hablar:

“La utilidad clínica de secuenciación exoma en enfermedades heterogéneas.”

Dr Nelen describió cómo una fuerte colaboración entre la investigación y los laboratorios de diagnóstico llevado a la aplicación de la secuenciación del exoma en el diagnóstico de enfermedades genéticas heterogéneas. Hizo hincapié en la importancia de un trabajo de equipo multidisciplinario para definir “paquetes” de genes para los que no había pruebas de su participación en cualquiera de discapacidad intelectual (Identificación), ceguera hereditaria, sordera hereditaria, movimiento trastorno o trastornos fosforilación oxidativa. La amplia diversidad de variantes genéticas que pueden causar enfermedades tales significa que la secuenciación de Sanger, una vez que el estándar de oro, se ha convertido en demasiado tiempo y es caro y da una menor “rendimiento diagnóstico” que exoma secuenciación.

Un aspecto crítico de la aplicación de secuenciación de alto rendimiento de exomes en un entorno de diagnóstico está ganando adecuado consentimiento informado de los pacientes y sus familias. Los pacientes y / o sus padres dieron su consentimiento informado para el análisis exoma completo. Los datos de la secuencia de los exomes de ~ 550 pacientes entraron en un oleoducto anotación genérica y análisis exoma se basara en una "otra vezLa estrategia para la identificación o una 'in silico'Estrategia dirigida para las otras enfermedades.

El análisis se basa en un planteamiento de dos fases:

1. Análisis de una “paquete” de genes definidos como altamente probable para llevar a variantes patogénicas:
   • ¿Quiere buscar variantes en estos genes sólo relacionados con la enfermedad.
   • Si variante patógena encontrado, análisis e informe final.
   • Si no variante patogénica encontrado, pasar a la segunda etapa:
2. Todo el análisis exoma:
   • Si no variante patogénica encontrado, búsqueda de mutaciones en un conjunto específico de genes candidatos.
   • Si una variante patógena se encuentra y hay pruebas sólidas para la interpretación clínica, reportar.
   • Finalmente, si los análisis anteriores no, el resto de la exoma se busca en colaboración con los investigadores y se podría informar sobre si este "nuevo" de datos contiene.

Una historia de éxito contada por el Dr. Nelen se refería a un caso específico de la discapacidad intelectual, en el que ninguna variante causante había sido identificado más de varios años de investigación por secuenciación de Sanger de genes candidatos sucesivos, mientras que el análisis exoma conjunto identificado una variante patogénica en elPACS1 gen.

En los casos en que “incidental” variantes se identifican, que parecen no tener relación con la enfermedad bajo investigación, estos se pasan y evaluadas por un equipo independiente de expertos para el asesoramiento, antes de informar.

Este análisis por niveles ha obtenido la certificación por las autoridades holandesas médicos como una prueba genética y así podría servir de modelo para otros países de la UE.

Escuchamos próximo Michael Mueller, de la Investigación Biomédica Centro NIHR, Imperial College de Londres, Reino Unido, sobre:

“Rapid secuenciación del genoma completo: la optimización de la tubería de bioinformática para los tiempos de respuesta más rápidos.”

Usando secuenciación del genoma completo (WGS) para la detección de la mutación puede ser más poderoso que el análisis restringido a sólo el exoma. Sin embargo, el procesamiento de datos y el manejo de los desafíos que plantea el WGS móviles en el laboratorio de diagnóstico son inmensas. Dr. Mueller describe cómo el hardware diferentes y enfoques de procesamiento paralelo de datos NGS podría optimizarse, presentando algunas mejoras. Sistemáticamente identificar cuellos de botella en cada etapa, fue capaz de reducir el tiempo necesario para producir las variantes comentadas, empezando por primas Illumina corto leer datos de un genoma de cobertura ~ 30x único, de ~ 24 a ~ 7 horas. Esto pareció alcanzarse sin comprometer lectura de mapas o variante de calidad llamando.

En un seguimiento de la charla de Marcel Nelen, Kornelia Neveling, también de la Radboud University Medical Centre, Nijmegen, habló sobre:

“Análisis de los datos de diagnóstico de secuenciación exoma”

Dr Neveling comenzó describiendo la configuración técnica de la Radboud University Medical Centre, a continuación, el manejo de muestras y control de calidad y, finalmente, las herramientas de software para ayudar en el filtrado de exoma variante de la secuencia y el análisis. El laboratorio de diagnóstico tiene acceso a tres Life Technologies 5500 secuenciadores utilizando la plataforma sólida y también dos secuenciadores Ion Torrent PGM.

Un paso crítico en el manejo de muestras y datos de control de calidad (QC) para asegurar que las decisiones finales clínicos son robustos; algunos de los pasos de control de calidad descritos por el Dr. Neveling eran:

1. La identificación fiable de las personas y las relaciones (hermano / padre / no relacionado)
2. Registro preciso de los metadatos para cada muestra por ejemplo. la versión del software se utilizó para el análisis? ¿Cuál fue la fecha del análisis?, etc.
3. Que la secuencia de datos son por ejemplo muy específica y sensible. dar suficiente, incluso la cobertura de todos los exones.
4. Llamadas variantes de secuencia satisfacer las expectativas biológicas, por ejemplo,. la relación de las transiciones a transversions refleja la variación natural.

La secuenciación de Radboud equipo de diagnóstico tienen ahora una base de datos sobre 1500 exomes individuales y han encontrado que un rendimientos típicos exoma unos 40,000 variantes, con ~ 150-200 de esas variantes estar “privado” para cada muestra. Dr Neveling presentó una herramienta de filtrado variante, con una interfaz gráfica de usuario que parecía que recuerda el softwaredescrito anteriormente por Margulies Elliot y descrito brevemente con la herramienta en un caso de paraplejia espástica hereditaria para ayudar en la identificación de la variante etiológico más probable.

Prof.. Anthony J Brookes terminó el Simposio, hablando:

“Asignación de patogenicidad para NGS derivados de las variantes”

Prof.. Brookes fue efervescencia de ideas, provocándonos a pensar en lo que realmente queremos decir por “patógeno”. Centrándose en las enfermedades raras, se nos recordó que el concepto de patogenicidad es una resbaladiza, multifacético un. Inferir patogenicidad puede significar una combinación de:

• conocer las frecuencias de alelos en las poblaciones de casos y controles
• si una variante ha sido descrito por otros como patógenas
• si una variante está ausente de bases de datos que se supone (a veces erróneamente) consistir principalmente “normal” variantes p.e.. dbSNP
• si una variante co-segrega con la enfermedad en un árbol genealógico
• lo que el predijo (o conocido) efecto de una variante se encuentra en la estructura de proteínas
• predicciones in silico de herramientas como PolyPhen o Sift
• ensayos funcionales a cabo en células humanas vivas
• ensayos funcionales o fenotípicos realizados en organismos modelo, por ejemplo,. mutantes de ratón

Otro nivel de sutileza en la manera en que definimos patogenicidad es que podemos pensar en dos contextos:

1. tiene una variante "causado’ un fenotipo en un paciente en particular o una familia (que se refiere a expresividad)?
2. lata una variante de "causa’ un fenotipo en una población (penetrancia)?

Prof.. Brookes argumentado que la accionabilidad clínico de una variante debe ser considerado como una combinación de patogenicidad, penetrancia y expresividad. Luego pasó a señalar que se sabe muy poco acerca de la relación entre el genotipo y el fenotipo y que necesitamos una serie de novedades para cerrar esa brecha y mejorar nuestra capacidad de reconocer las variantes patógenas. En particular, argumentó que un sistema de base de datos de intermediario estaba obligado a unir los recursos primarios, como dbSNP o Ensembl con bases de datos clínicos, para facilitar el intercambio de datos sin comprometer la confidencialidad. La combinación de este ecosistema base de datos '’ con datos de alta calidad de los registros de salud electrónicos deberían mejorar nuestra comprensión de la relación genotipo-fenotipo.

El simposio dio una buena visión general de la forma en que NGS está siendo tomado en laboratorios de genética y de diagnóstico utilizado para mejorar la tasa de éxito en la identificación de variantes causales. A su vez, este desarrollo tecnológico debe conducir a una mejor elección informada de las terapias o tratamientos. Será interesante ver cuánto hemos avanzado en un año, cuando una reunión de seguimiento está prevista.

Si alguien quiere ponerse en contacto para discutir, corregir o actualizar mis resúmenes, por favor enviar un comentario, abajo, o bien, enviando un tweet:

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