Spostamento di sequenziamento di nuova generazione in Clinica, parte 2

primo tentativo di tweet in diretta da #ngs2013 http://t.co/SbWrGx8weI

— Paul Denny (@ Pauldennyuk) Marzo 12, 2013

Nel mio ultimo post, Ho riassunto le prime quattro colloqui di questo simposio:

1Oxford st Workshop e simposio, 4Conoscenza ° Techgene Network Meeting,
“NGS2013 sequenziamento di nuova generazione: Bioinformatica e Analisi dei dati”

Si potrebbe anche leggere i tweet dalla riunione qui. Ma sto divagando. La sessione pomeridiana è iniziata impressionante con Marcel Nelen, dalla Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Paesi Bassi si parla di:

“L'utilità clinica di sequenziamento exome nelle malattie eterogenee.”

Dr Nelen descritto come una forte collaborazione tra la ricerca e laboratori di diagnostica ha comportato l'applicazione di sequenziamento exome nella diagnosi delle malattie genetiche eterogenee. Egli ha sottolineato l'importanza di un lavoro di squadra multidisciplinare per definire “Pacchetti” di geni per i quali non vi era evidenza di coinvolgimento in entrambe le disabilità intellettiva (ID), cecità ereditaria, sordità ereditaria, disturbi del movimento o disturbi fosforilazione ossidativa. La grande varietà di varianti genetiche che possono causare tali malattie significa che il sequenziamento Sanger, una volta che il gold standard, è diventata troppo lunga e costosa e dà una minore “resa diagnostica” exome di sequenziamento.

Un aspetto critico di applicare high-throughput sequenziamento del exomes in un contesto diagnostico sta guadagnando il consenso informato dei pazienti e delle loro famiglie. I pazienti e / oi loro genitori hanno dato il consenso informato per l'analisi exome intero. I dati di sequenza dei exomes di ~ 550 pazienti entrati in una pipeline di annotazioni generiche e analisi exome si è basata sia su un 'di nuovo'Strategia per ID o di un'in silico'Strategia mirata per le altre malattie.

Analisi si basa su un approccio a due fasi:

1. Analisi di un “pacchetto” di geni definiti come altamente probabile per effettuare varianti patogeniche:
   • Cerca varianti in malattia solo questi geni correlati.
   • Se trovate variante patogena, fine l'analisi e la relazione.
   • Se non trovate variante patogena, passare alla seconda fase:
2. Tutta l'analisi exome:
   • Se non trovate variante patogena, cercare mutazioni in uno specifico insieme di geni candidati.
   • Se una variante patogena viene trovato e non vi è prova solida per l'interpretazione clinica, segnalare.
   • Infine, se le analisi precedenti falliscono, il resto della exome viene cercato, in collaborazione con i ricercatori e potrebbe essere riportato, se tale dato "nuovo" tiene.

Una storia di successo raccontata dal dottor Nelen riguardava un caso specifico di disabilità intellettiva, in cui nessuna variante causale è stato identificato in diversi anni di indagine da parte sequenziamento Sanger di geni candidati successivi, considerando che tutta l'analisi exome identificato una variante patogena nelPACS1 gene.

Nei casi in cui “incidentale” varianti sono indicate, che sembrano non hanno alcuna relazione con la malattia in esame, questi sono passati e valutate da un gruppo indipendente di esperti per la consulenza, prima segnalazione.

Questa analisi a più livelli ha ottenuto la certificazione da parte delle autorità olandesi medici come un test genetico e quindi potrebbero fungere da modello per altri paesi dell'UE.

Abbiamo sentito prossimo da Michael Mueller, dal Centro di ricerca biomedica NIHR, Imperial College di Londra, Regno Unito, circa:

“Rapid intero sequenziamento del genoma: ottimizzare la pipeline bioinformatica per i tempi di consegna più rapidi.”

Utilizzo di tutto il sequenziamento del genoma (WGS) per il rilevamento di mutazione può essere più potente di analisi limitati al solo exome. Tuttavia, il trattamento dei dati e di far fronte alle sfide poste dalla WGS si spostano nel laboratorio di diagnostica sono immense. Il dottor Mueller descritto come hardware diversi e approcci in parallelo trattamento dei dati NGS può essere ottimizzato, presentando alcune notevoli miglioramenti. Sistematicamente strozzature identificando in ciascuna fase, fu in grado di ridurre il tempo necessario per produrre varianti annotati, a partire da prime Illumina breve lettura dei dati da un genoma di copertura ~ 30x singolo, da ~ 24 a ~ 7 ore. Questo sembra essere raggiunto senza compromettere la lettura mappatura o variante di qualità chiamando.

In un follow-up per il discorso di Marcel Nelen, Kornelia Neveling, anche dalla Radboud University Medical Centre, Nijmegen, ha parlato:

“L'analisi dei dati per la diagnostica exome sequenziamento”

Dr Neveling iniziato descrivendo la configurazione tecnica presso l'Università Radboud Medical Centre, poi manipolazione del campione e il controllo della qualità e, infine, strumenti software per aiutare nella filtraggio exome variante di sequenza e analisi. Il laboratorio di diagnostica ha accesso a tre Life Technologies 5500 sequencer che utilizzano la piattaforma solida e anche due Ion Torrent sequencer PGM.

Un passo fondamentale nella manipolazione dei campioni e dei dati è il controllo della qualità (QC) per garantire che le decisioni cliniche finali sono robusti; alcuni dei passi QC descritte dal dott Neveling erano:

1. Identificazione affidabile degli individui e delle relazioni (fratello / genitore / estraneo)
2. Registrazione accurata di metadati per ciascun campione per esempio. quale versione software è stato utilizzato per l'analisi? Qual è la data di analisi?, ecc.
3. Che i dati di sequenza sono ad esempio altamente specifico e sensibile. dare sufficiente, anche la copertura di tutti gli esoni.
4. Chiamate varianti di sequenza soddisfare le aspettative dei biologici ad esempio. il rapporto di transizioni per trasversioni riflette variazione naturale.

Il Radboud sequenziamento squadra diagnostica ora dispone di un database di circa 1500 exomes individuali e hanno scoperto che un rese tipiche exome su 40,000 varianti, con ~ 150-200 di tali varianti essendo “privato” per ogni campione. Dr Neveling presentato uno strumento variante filtraggio, con un'interfaccia utente grafica che sembrava ricorda il softwaredescritto in precedenza Margulies da Elliot e descritto brevemente utilizzando lo strumento in un caso di paraplegia spastica per facilitare l'identificazione della variante più probabile eziologico.

Prof.. Anthony J Brookes ha chiuso il Simposio, parlando di:

“Assegnazione di patogenicità per NGS-derivati ​​varianti”

Prof.. Brookes è stato frizza con le idee, ci provoca a pensare a ciò che realmente intende per “patogeni”. Concentrandosi sulle malattie rare, ci è stato ricordato che il concetto di patogenicità è scivoloso, pluralità di aspetti. Inferenza patogenicità può significare una combinazione di:

• sapendo frequenze alleliche nelle popolazioni di casi e di controllo
• se una variante è stata descritta anche da altri patogeni
• se una variante è assente dal database che vengono assunti (a volte erroneamente) consistere principalmente “normale” varianti e.g. dbSNP
• se una variante co-segrega con la malattia in un pedigree
• ciò che il predetto (o noti) effetto di una variante è sulla struttura delle proteine
• previsioni in silico da strumenti come PolyPhen o Sift
• saggi funzionali eseguiti in cellule viventi umane
• saggi funzionali o fenotipica svolte in organismi modello per esempio. topo mutanti

Un altro livello di sottigliezza nel modo in cui definiamo la patogenicità è che possiamo pensare a due contesti:

1. ha una variante 'causato’ un fenotipo in un particolare paziente o famiglia (che riguarda espressività)?
2. lattina una variante perche '’ un fenotipo in una popolazione (penetranza)?

Prof.. Brookes ha sostenuto che l'azionabilità clinica di una variante, devono essere pensato come una combinazione di patogenicità, penetranza ed espressività. Ha continuato a sottolineare che si sa troppo poco sul rapporto tra genotipo e fenotipo, e che abbiamo bisogno di una serie di sviluppi di colmare questa lacuna e migliorare la nostra capacità di riconoscere le varianti patogeni. In particolare, ha sostenuto che un sistema di database intermediario è stato richiesto di collegare tra loro le risorse primarie come dbSNP o Ensembl con i database clinici, per facilitare la condivisione dei dati senza compromettere la riservatezza. La combinazione di questo ecosistema database '’ con i dati ad alta qualità, cartelle cliniche elettroniche dovrebbe migliorare la nostra comprensione della relazione genotipo-fenotipo.

Il simposio ha dato una buona panoramica del modo in cui NGS è stato ripreso in laboratori di diagnosi genetica e utilizzato per migliorare il tasso di successo per identificare varianti causali. A sua volta, questo sviluppo tecnologico dovrebbe portare ad una migliore scelta informata di terapie o trattamenti. Sarà interessante vedere quanto abbiamo progredito in un anno, quando una riunione è prevista followup.

Se qualcuno volesse entrare in contatto per discutere, correggere o aggiornare i miei riassunti, si prega di inviare un commento, al di sotto di, o mandatemi un tweet:

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